Transparisation des échantillons


Des embryons transparents, la technique de la transparisation:

SeeDB chick Embryo clearing with Flo 400

Seedb clearing 48 heures avec Flo400. Obtenu par Equipe Castellani INMG

Les techniques de transparisation (Clearing) sont utilisées en biologie pour rendre des échantillons initialement opaques en des échantillons transparents. Elles consistent à remplacer certains tissus opaques comme les graisses présents dans les échantillons, par différents réactifs totalement transparents. Le but est de réussir à rendre l’échantillon biologique transparent tout en conservant sa forme et sa taille et en empêchant la perte de la fluorescence présente au cœur des cellules mutées.
Bien que différents protocoles sont apparus les uns après les autres au cours des dernières années, la complexité de certains les ont rendus extrêmement compliqués à utiliser dans des conditions de laboratoires notamment par l’utilisation de réactifs nocifs.
Nous avons étudié l’utilisation de 6 protocoles différents pour en adapter 3 sur notre automate Flo400.

Le plus rapide, le 3DISCO:

3 DISCO on Chick Embryo after double Immunostaining.

3DISCO sur embryons de poulet après double IF, Cell reports, Belle et al. 2014

Ce protocole est le plus court puisque la durée totale actuelle pour le réaliser sur notre automate est de 14 heures. après un passage de tétrahydrofurane à concentration croissante dans les échantillons, le dichlorométhane et le di-benzyléther viennent stabiliser les échantillon jusqu’à obtenir des échantillons totalement transparents. Ce Protocole permet de conserver les tailles des embryons mais également les marquages fluorescents obtenus après Immunohistochimies.
Attention cependant, Le Tetrahydrofurane est un réactif hautement toxique et nécessite d’être manipulé sous hotte. De plus, ce composé détruit certains plastiques tels que polypropylène, Il vous faudra donc utiliser des tankers en polystyrène.

 

Le ClearT2, pour conserver les proportions:

Clear T2 on Mice Brain for conservation of proportion

Clear T2 brain, development 140, kuwajima et al. 2013

Ce protocole est très efficace pour la clarification des échantillons contenants des cellules mutées fluorescentes. En effet, en 16 heures seulement,
votre échantillon devient totalement transparent et conserve intégralement l’expression de la fluorescence dans les cellules voulues. De plus, ce protocole conserve les dimensions de votre échantillon de façon complète. Il conserve également les immunomarquages fluorescents. Il utilise cependant du Formamide qui est un composé nocif et nécessite donc d’être utilisé sous hottes. De plus, la transparence de l’échantillon n’est stable que durant un à deux jours avant de redevenir opaque (cependant, un autre passage dans le protocoles ClearT2 le fait redevenir transparent.)

 

Le SeeDB, le moins nocif et le plus économique:

Chick Embryo Clearing After IHC and immunofluorescence

Immunofluorescence de neurofilaments après clarification au seeDB 24 heures. Obtenu par Equipe Castellani INMG

Ce protocole, un peu plus long que les 2 autres (24 heures avec le Flo 400, 96 en manuel) est le plus économique et le moins nocif des trois. Il consiste à incorporer une solution de fructose à concentration croissante petit à petit dans l’échantillon. Les solutions sont composées uniquement de fructose et de α-thioglycérol (produit irritant) qui prennent la place des acides gras présents et rendent l’embryon transparent. Avec ce protocole, la transparence et la fluorescence sont conservées durant plus de 3 semaines si les échantillons sont mis à l’obscurités.
Actuellement, Flogentec dispose du record de durée de clarification par ce protocole.

 

Ces trois protocoles  (SeeDB, 3DISCO et ClearT) ont été adaptés par notre équipe pour vous permettre de clarifier vos échantillons en toute simplicité et de façon totalement automatique. Les performances offertes par le Flo 400 vous permettent de clarifier plus de 50 échantillons en un seul protocoles en diminuant considérablement la quantité de réactifs nécessaires grâce à son système de flux recyclés.
Nous vous proposons ainsi le premier automate à pouvoir effectuer les techniques d‘hybridation in situ, d’immunohistochimies mais également de clarification sur des échantillons wholemount.

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